上海信帆生物科技有限公司為了建立能穩(wěn)定分泌高親和力、高特異性抗大鼠胃泌素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,在對其親和力、特異性以及生物學(xué)功能進(jìn)行鑒定的基礎(chǔ)上,克隆抗大鼠胃泌素單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因,構(gòu)建抗大鼠胃泌素單鏈抗體基因,在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá),并對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行初步鑒定。

       以胃泌素合成肽與鑰孔戚血藍(lán)蛋白的偶聯(lián)物為免疫原,采用雜交瘤技術(shù)建立能穩(wěn)定分泌高親和力抗大鼠胃泌素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,大量制備并經(jīng)鹽析、蛋白G親和層析獲得純化的單克隆抗體,采用SDS-PAGE對抗體進(jìn)行分子量和純度鑒定,間接ELISA法檢測效價(jià),雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)鑒定類和亞類,非競爭酶免疫實(shí)驗(yàn)測定親和力,斑點(diǎn)ELISA和免疫組化鑒定特異性,并且分別采用熒光染色法和MTT比色法,研究其對胃泌素/胃泌素受體結(jié)合的阻斷作用,以及對SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制作用.在此基礎(chǔ)上,選擇雜交瘤細(xì)胞株E8,用TRIZOL試劑提取總RNA,通過RT-PCR,采用小鼠重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通用引物,擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因.通過重疊延伸PCR將兩個(gè)可變區(qū)基因通過連接肽基因連接起來,構(gòu)建單鏈抗體基因,克隆到pGEM-T載體中,通過酶切、PCR和測序進(jìn)行鑒定.然后用限制性內(nèi)切酶雙酶切pGEM-gastrin-ScFv質(zhì)粒和pET-28a(+)質(zhì)粒,構(gòu)建pET-gastrin-ScFv重組表達(dá)質(zhì)粒.轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后,篩選陽性菌株,通過酶切、PCR進(jìn)行鑒定.陽性菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后,分離包涵體,進(jìn)行變性和復(fù)性處理,通過SDS-PAGE和競爭抑制ELISA對表達(dá)蛋白的分子量和活性進(jìn)行初步鑒定.